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正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究

发布时间:2007-04-28来源:《西安交通大学学报》2007年4月28卷2期 作者:齐宝宁,易建华,唐国 点击:

【摘要】 目的 研究正己烷(n?hexane)对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞DNA损伤的影响。方法 40只雄性SD大鼠随机分成5组,即阴性对照组、75、150、300mg/kg染毒组和阳性对照组,每组8只。经腹腔注射染毒4周后,检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)的活力,血清还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量;用彗星试验技术(SCGE)检测大鼠肝细胞DNA的损伤。 结果 大鼠体重随染毒时间而增加,阴性对照组增加最快;随染毒剂量增加,肝组织匀浆中SOD、GSH?Px活力、血清GSH含量明显降低,而血清MDA含量增大,组间比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01);肝细胞SCGE检测彗星尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均增大,组间比较有显著性差异(P<0.01),尾矩值与染毒剂量作相关分析,相关系数r为0.981,呈正相关(P<0.05)。 结论 正己烷可引起或增强机体氧自由基反应,导致脂质过氧化损伤和肝细胞DNA损伤。

【关键词】 正己烷;脂质过氧化;DNA损伤;单细胞凝胶电泳技术

  正己烷(n?hexane,CAS:110?54?3)属于直链饱和脂肪烃类,化学式为C6H14,分子式为CH3(CH2)4CH3,分子量86.18;无色、高挥发性、易燃、常温下为微有异臭的液体;几乎不溶于水,易溶于氯仿、乙醚、乙醇[1?2]。正己烷主要作为溶剂,广泛应用于制鞋、印刷、电子、粘胶配制、除污、干洗、植物油提取等行业[3]。有文献表明[4?5]:正己烷对神经细胞脂质有极化作用,导致膜扩张,通透性增强。动物吸入正己烷后,血中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、葡萄糖?6?磷酸脱氢酶、酸性脱氢酶、β尿苷酸化酶活性增高。这些内酶的外逸,间接说明正己烷具有膜损伤作用。沈齐英等[6]对大鼠静式急性吸入染毒,测定了MDA、GSH、SOD和GSH?Px等体现脂质过氧化损伤的特异性指标。结果表明,正己烷的急性吸入导致机体氧化还原系统的变化,削弱了机体消除自由基的能力,发生了脂质过氧化损伤。正己烷引起机体氧化还原系统的改变,导致自由基水平升高,是否会进一步引起DNA损伤,目前尚未见有报道。故本实验用不同剂量的正己烷染毒大鼠,对其脂质过氧化和DNA损伤进行检测。旨在观察正己烷对大鼠的脂质过氧化及DNA损伤的影响,为探讨正己烷的遗传毒性和中毒机制提供理论依据和实验数据。

  1 材料与方法


  1.1 材料

  1.1.1 动物

  健康雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠40只,体重180-220g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,适应性喂养一周后进行染毒实验。

  1.1.2 试剂

  正己烷(国产分析纯),环磷酰胺(上海华联制药有限公司),Triton X?100(Gibco公司,美国),戊巴比妥钠、低熔点琼脂糖(low melting agarose gel, LMA)、正常熔点琼脂糖(normal melting agarose gel, NMA)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2?ethylenediamine, Na2EDTA)、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)均为美国Sigma公司产品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH?Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。

  1.1.3 仪器

  DYYⅢ水平电泳槽 ,DYY Ⅲ?33A电泳仪 ,NIKON荧光显微镜型及NIKON AFX?ⅡA型拍摄装置 ,恒温水浴箱,DY89?Ⅱ型电动玻璃组织匀浆器,CASP图像分析软件。

  1.2 方法

  1.2.1 动物分组及染毒

  将40只雄性SD大鼠随机分为5组,即阴性对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组和阳性对照组(环磷酰胺),每组8只,采用腹腔注射染毒[5]。阴性对照组仅用注射针穿刺腹腔,不注射任何试剂,低、中、高暴露组染毒剂量分别为75、150、300mg/kg,阳性对照组为50mg/kg,每日上午染毒1次,每周5d,连续4周。染毒过程中,所有大鼠均自由饮水、进食。每3d称体重1次,调整染毒剂量,记录大鼠的一般状况和体重变化。

  1.2.2 单细胞凝胶电泳试验

  参照Singh等[7]方法略加改进。主要步骤有:①单细胞悬液的制备。染毒结束后,用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠,剖开腹部,立即取出一5nm×5nm肝脏组织,装于盛有4℃磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)的小烧杯中,洗去血液,然后加入RPMI 1640培养液,用眼科剪剪碎,制成单细胞悬液。② 胶板的制备。将预热50℃ 100μL质量分数为0.6%的NMA滴加到无水乙醇浸泡的磨砂载玻片上,迅速盖上干净的盖玻片,室温下静置10min使其凝固,为第1层凝胶;取10μL大鼠肝细胞悬液加入37℃ 80μL质量分数为0.5%的LMA中,混匀后迅速滴加到第1层胶上,立即盖上干净的载玻片,室温下静置10min使其凝固,为第2层胶;最后在第2层胶上滴加预热37℃的质量分数为0.5%的LMA,盖上盖玻片,室温下使其凝固。③细胞裂解。移去盖玻片,将载玻片浸入新配制的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl,100nmol/L Na2EDTA,10nmol/L Tris,10g/L肌氨酸钠,临用前加体积分数为1%的TritonX?100,10% DMSO,pH=10)中,于4℃冰箱中裂解1h。④碱解旋。从裂解液中取出载玻片,用PBS冲洗2次,洗去过多的盐,晾干后置于水平电泳槽中,将新配制的电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA,300mmol/L NaOH,pH=13,4℃预冷)倒入电泳槽中,液面约覆过胶面0.25cm左右,避光静置25min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA,使DNA断片在电泳场中易于迁移。⑤电泳。电压为25V,电流300mA,4℃环境下电泳20min。⑥中和与染色。电泳结束后,取出载玻片,吸水纸吸干电泳缓冲液,用0.4mol/L的Tris?HCl(pH=7.5)中和15min,然后每片载玻片上滴加30mg/L的EB水溶液50μL,盖上盖玻片,染色20min,即可观察。⑦阅片。24h内在荧光显微镜下观察,数码相机拍摄照片,每张玻片随机拍摄30个细胞,在电脑上用CASP彗星软件分析。

  1.2.3 血清脂质过氧化指标的测定

  染毒结束后,用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹部开U型口,暴露心脏,从心尖抽取5mL全血,置于试管中,37℃水浴2h,离心(3000r/min,10min),分离血清检测GSH和MDA含量。MDA含量测定按硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法,GSH含量测定按Haffeman微量法。
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